IPSC生成通常是實(shí)現(xiàn)真正的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)的中間步驟。

它一般應(yīng)用于：

人胚胎發(fā)育建模；

作為難以分離的細(xì)胞來(lái)源，用于基礎(chǔ)研究和疾病建模；

藥物篩選應(yīng)用；

細(xì)胞替代治療。

IPS神經(jīng)分化的protocol，以下是神經(jīng)細(xì)胞的分化操作步驟，可供參考：

準(zhǔn)備好神經(jīng)誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基，建議使用Essential 8TM培養(yǎng)基以Matrigel基質(zhì)膠作為基質(zhì)，或者使用StemPro hESC SFM培養(yǎng)基以Geltrex作為基質(zhì)。

1、高品質(zhì)的PSCs（無(wú)分化或者僅含少量分化的克?。┦沁M(jìn)行有效的神經(jīng)誘導(dǎo)的關(guān)鍵。在傳代PSCs時(shí)去除所有的或者大部分分化的克隆。分化的克隆可以通過(guò)使用Nikon顯微標(biāo)志和Nikon顯微C-OA 15mm目標(biāo)適配器被標(biāo)記

2、當(dāng)PSCs達(dá)到~70-80%融合時(shí)，根據(jù)PSC分種實(shí)驗(yàn)方法將PSC接種到6孔板中在分種PSC團(tuán)塊前，確定分種的密度，方法如下：

3、當(dāng)準(zhǔn)備好PSC細(xì)胞懸液后，取部分細(xì)胞到15-ml錐形管中來(lái)估算PSC細(xì)胞懸液的總細(xì)胞量（如，將6孔板的一個(gè)孔中的細(xì)胞制備成6ml PSC細(xì)胞懸液，鄧1ml來(lái)進(jìn)行細(xì)胞數(shù)估算）。

4、將裝有細(xì)胞的15-ml錐形管以200×g離心3分鐘，棄上清。

5、加入1ml預(yù)熱的StemPro Accutase細(xì)胞消化液，37度孵育5分鐘。

6、用1ml的移液管上下猛烈的吹吸5次，將細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液。

7、選擇你常用的方法計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)。如果在1ml Accutase細(xì)胞消化液中的總細(xì)胞數(shù)為1×10^6，那么剩下的5ml PSC細(xì)胞懸液中的總細(xì)胞數(shù)為1×10^6×5=5×10^6

8、加入2.5ml PSC培養(yǎng)基至包被好的6孔板的每個(gè)孔中。

9、溫和的混勻有PSC細(xì)胞懸液的錐形管，將PSCs以2.5×10^6-3×10^5的數(shù)量接種到每個(gè)孔中。例如，如果PSC懸液為1×10^6個(gè)細(xì)胞/ml，將0.25-0.3ml PSC懸液加入到每個(gè)孔中。

10、快速的前后左右晃動(dòng)培養(yǎng)皿，將細(xì)胞分散到整個(gè)表面，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

以下點(diǎn)需要注意：

1、分種 的比例根據(jù)在分種前PSCs的融合程度用PSC細(xì)胞系類型的不同而有所差異。在分種后的第一天即開始進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)（大約傳代后24小時(shí)）。在傳代PSCs時(shí)，PSCs的起始密度應(yīng)該在15-25%的融合細(xì)胞需要以團(tuán)塊狀接種，避免成為單個(gè)細(xì)胞。單個(gè)細(xì)胞接種PSC易增加細(xì)胞的死亡。

2、在分種的時(shí)候可以將10um ROCK抑制劑加入到PSC培養(yǎng)基中處理過(guò)夜，以防止細(xì)胞的死亡。

3、如果起始用的PCS狀態(tài)很差，非神經(jīng)樣的克隆將會(huì)在培養(yǎng)中出現(xiàn)。在這種情況下，可以有兩種操作選擇：

a、如果僅在培養(yǎng)皿的極少區(qū)域出現(xiàn)該細(xì)胞形態(tài)，在挑除非神經(jīng)樣分化的克隆后可以繼續(xù)培養(yǎng)。為了去除非神經(jīng)樣分化的克隆，先用顯微標(biāo)記出所有非神經(jīng)樣分化的克隆。傾斜培養(yǎng)皿，用巴氏玻璃吸管將標(biāo)記的克隆吸掉去除。將培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)180度，重復(fù)以上步驟。操作每個(gè)孔時(shí)均重復(fù)以上步驟，以避免細(xì)胞缺少培養(yǎng)基而需經(jīng)受無(wú)培養(yǎng)基壓力。

b、如果出現(xiàn)了大量的非神經(jīng)樣的克隆，建議放棄繼續(xù)培養(yǎng)，而選擇高品質(zhì)的PSCs重頭開始。

c、更換培養(yǎng)基一定要注意，請(qǐng)預(yù)熱*培養(yǎng)基，冰冷的培養(yǎng)基加入會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞皺縮和漂浮。

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